| 公开号 |
101205538 |
| 公开日 |
2008年6月25日 |
| 申请人 |
中国农业科学院上海兽医研究所 |
| 发明人 |
林矫矫 陶丽红 苑纯秀 姚利晓 傅志强 冯新港 刘金明 石耀军 王欣之 贾人初
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| 摘要 |
本发明公开了利用ＲＡＣＥ技术从日本血吸虫１９天童虫中首次扩增到一个Ｗｎｔ家族基因，序列分析表明该基因的完整编码框含１３１１ｂｐ，编码４３６个氨基酸，理论分子量４９．６ｋＤ。同源性分析结果表明，该基因的氨基酸序列具有典型Ｗｎｔ家族蛋白特征，与日本三角涡虫、人Ｗｎｔ４的氨基酸序列相似性分别达４３％、３７％，推测为血吸虫的Ｗｎｔ４基因，命名为Ｓｊｗｎｔ４（ＧｅｎＢａｎＫ登陆号ＤＱ６４３８２９）。实时定量ＰＣＲ分析显示该基因在１４天童虫、１９天童虫、３１天成虫、４４天雌虫及４４天雄虫中均有表达，本发明构建了该基因的原核表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－２－Ｓｊｗｎｔ４，应用大肠杆菌系统进行了表达，表达蛋白以包涵体形式存在，Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹显示表达产物能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别。 |
| 法律状态 |
| 法律状态公告日 |
法律状态 |
法律状态详情 |
| 20080625 |
公开 |
公开 |
| 20080820 |
实质审查的生效 |
实质审查的生效 |
| 20101013 |
授权 |
授权 |
| 20120314 |
专利权的终止 |
未缴年费专利权终止 |
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| 主权利要求 |
一种日本血吸虫信号转导蛋白Ｓｊｗｎｔ－４基因的克隆和表达，其特征在于该方法包括下列步骤：（１）材料Ｔｒｉｚｏｌ、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ↑［ＴＭ］Ｋｉｔ；ＥｘＴａｑＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡ聚合酶、限制性内切酶ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、Ｔ４ＤＮＡ连接酶、荧光定量ＰＣＲ检测试剂盒和随机引物；羊抗鼠ＩｇＧ－ＨＲＰ抗ＧＳＴ单抗；羊抗兔ＩｇＧ－ＨＲＰ；逆转录酶；ＲＮＡ酶抑制剂；ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ和Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ；（２）菌种、质粒及实验动物质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－２、大肠杆菌ＤＨ５α、ＢＬ２１ＤＥ３由上海兽医研究所提供；ｐＵＣｍ－Ｔ载体；新西兰白兔雄性，２．５～３．０ｋｇ；日本血吸虫中国大陆株尾蚴由上海兽医研究所提供；新西兰白兔分别以腹部贴片法感染２００００，５０００，２０００条血吸虫尾蚴，在１４天、１９天、３１天和４４天后剖杀，以肝门静脉灌注法收集虫体，液氮冻存备用；（３）方法①总ＲＮＡ的提取取液氮中冻存的日本血吸虫１９天童虫２００ｍｇ，按Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒说明书进行总ＲＮＡ的提取；②ＲＡＣＥ的引物设计和扩增利用双向电泳结合肽质量指纹图谱技术获得一个Ｗｎｔ家族蛋白的一段肽序列，以此肽序列为询问序列在日本血吸虫ＥＳＴ库中搜索到一个日本血吸虫的相应ＥＳＴ片断ＧｅｎＢａｎｋ↑［ＴＭ］ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＡＡＭ８９８７２，长７２７ｂｐ，不含有完整的ＯＲＦ，以该ＥＳＴ序列为模板设计合成ＲＡＣＥ引物，３′ＲＡＣＥ的两个巢式引物：３ＧＳＰ１：５′－ＴＡＴＧＣＴＧＴＧＧＴＣＧＡＧＧＡＴＴＴＡＡＡＣＧ－３′，３ＧＳＰ２：５′－ＧＧＴＧＴＴＧＣＡＡＡＧＴＴＧＴＣＴＧＴＡＡＡＡＣＡ－３′；５′ＲＡＣＥ的两个巢式引物：５ＧＳＰ１：５′－ＧＧＴＧＴＴＧＣＡＡＡＧＴＴＧＴＣＴＧＴＡＡＡＡＣＡ－３′，５ＧＳＰ２：５′－ＴＴＧＴＣＧＴＴＴＡＡＡＴＣＣＴＣＧＡＣＣＡＣＡＧ－３′；具体步骤按ＧｅｎｅＲａｃｅｒ↑［ＴＭ］试剂盒操作手册进行，将ＲＡＣＥ产物克隆到试剂盒提供的ｐＣＲ４－ＴＯＰＯ载体中，挑选阳性克隆测序，利用ＤＮＡＳｔａｒ软件查找３′、５′ＲＡＣＥ产物序列与原ＥＳＴ序列的重叠部分，将三段序列拼接；③含ＯＲＦｃＤＮＡ片断的扩增根据拼接的ｃＤＮＡ序列设计引物Ｆ１和Ｆ２进行含ＯＲＦｃＤＮＡ片断的扩增，Ｆ１：５′－ＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＴＣＴＡＡＣＴＣＡＧＣＴＡＧＡＡ－３′引入酶切位点ＢａｍＨＩ加下划 |
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