| 公开号 |
103205396A |
| 公开日 |
2013年7月17日 |
| 申请人 |
中山康方生物医药有限公司 |
| 发明人 |
王谦 孙艺飞 张鹏 王忠民 夏瑜 李百勇
|
| 摘要 |
本发明涉及一种ＨＥＫ－２９３Ｔ细胞的悬浮驯化和无血清驯化的方法，属于生物技术领域。本发明分两步进行，先ＨＥＫ－２９３Ｔ细胞由贴壁培养驯化为在带血清的培养基中悬浮培养，再对适应含血清培养基中悬浮培养的ＨＥＫ－２９３Ｔ细胞降血清驯化至无血清驯化。本发明培养出的ＨＥＫ－２９３Ｔ细胞生长状态稳定，分散性好，完全适应在无血清且化学成分确定的培养基中进行悬浮培养，能够规模化生产。 |
| 法律状态 |
| 法律状态公告日 |
法律状态 |
法律状态详情 |
| 20130717 |
公开 |
公开 |
| 20130814 |
实质审查的生效 |
实质审查的生效 |
| 20150325 |
授权 |
授权 |
|
| 主权利要求 |
１．一种ＨＥＫ－２９３Ｔ细胞的悬浮驯化方法，其特征在于包括以下步骤：ａ、接种ＨＥＫ－２９３Ｔ细胞于含１０ｍｌ ＤＭＥＭ完全培养基的１０ｃｍ培养皿中，放于３７℃，５％ＣＯ２的培养箱中培养２天达到１００％汇合状态；ｂ、弃除培养基并加入０．２５％胰酶ＥＤＴＡ使ＨＥＫ－２９３Ｔ细胞消化脱离培养皿表面，然后加入３ｍｌ ＤＭＥＭ完全培养基终止胰酶消化；ｃ、将上述消化后的细胞用移液管吸取，并转移到１５ｍｌ的尖底离心管中，１０００ｒｐｍ离心１ｍｉｎ，沉降收集ＨＥＫ－２９３Ｔ细胞，并用１０ｍｌＤＭＥＭ完全培养基重悬收集的细胞，再将全部细胞接种于１０ｃｍ康宁培养皿中，放于３７℃，５％ＣＯ２的培养箱中；ｄ、步骤ｃ中放入培养箱中的细胞每培养２天重复步骤ｂ和ｃ，重复７－９次，直至培养皿中同时出现贴壁细胞和悬浮生长的细胞团；吸取及转移过程中注意勿打散细胞团；ｅ、将最后一次培养的全部细胞消化后转移至摇瓶中培养，每两天按照０．３×１０６／ｍｌ传代一次，每次传代均用０．２５％胰酶ＥＤＴＡ消化细胞团至分散状态，直至培养两天后能达到１．２×１０６／ｍｌ细胞，活力９５％以上，即得可连续传代９５－１０５代，并可达到最高密度１．１×１０７／ｍｌ的，适应１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ培养基悬浮培养的ＨＥＫ－２９３Ｔ细胞，命名该悬浮培养细胞为ＨＥＫ－２９３Ｔｓ细胞，以３×１０６／ｍｌ密度冻存即可。 |
| 在线阅读 |
请登陆
|
鲁公网安备 37060202000128号