公开号：1624103
公开日：2005年6月8日
申请人： 西南师范大学
发明人：谈锋 胡凯 祝顺琴 唐克轩 廖志华
摘要：一种提高红豆杉内生真菌发酵物中紫杉醇产率的方法，本方法利用产紫杉醇内生真菌与产紫杉醇合成前体１０－去乙酰巴卡亭Ⅲ和巴卡亭Ⅲ分别单独培养，然后将培养物进行混合培养，并适当补加培养基，大幅度提高发酵物中紫杉醇的产率。本方法的优点在于利用两种同类真菌代谢途径互补大幅提高发酵物中紫杉醇的含量，大大高于产紫杉醇内生真菌单独培养的产率水平。使利用内生真菌进行工业化发酵培养生产紫杉醇成为可能。本方法不但适用于产紫杉醇内生真菌与产紫杉醇合成前体的内生真菌混合培养，提高培养物中紫杉醇含量。也适宜于产生天然有用成分的内生真菌与产生天然有用成分合成前体的内生真菌混合培养，提高培养物中天然有用成分的含量。
法律状态：

法律状态公告日	法律状态	法律状态详情
20050608	公开	公开
20050810	实质审查的生效	实质审查的生效
20070314	授权	授权
20110119	专利权的终止	未缴年费专利权终止

主权利要求：一种提高红豆杉内生真菌发酵物中紫杉醇产率的方法，其特征在于：将产紫杉醇内生真菌与产紫杉醇合成前体１０－去乙酰巴卡亭Ⅲ和巴卡亭Ⅲ内生真菌的培养物进行混合培养，大幅度提高发酵物中紫杉醇的产率，步骤如下：（１）培养基制备①ＰＤＡ培养基：②发酵培养基：葡萄糖２－１０ｇ／Ｌ蔗糖１０－２０ｇ／Ｌ蛋白胨０．５－２．５ｇ／Ｌ醋酸钠０．５－３ｇ／ＬＭｇＳＯ↓［４］２－５ｍｇ／ＬＣａ（ＮＯ↓［３］）↓［２］５－１００ｍｇ／ＬＣｕＳＯ↓［４］０．５－３００ｍｇ／ＬＺｎＳＯ↓［４］０．５－２００ｍｇ／ＬＭｎＣｌ↓［２］１－２５ｍｇ／ＬＦｅＣｌ↓［３］０．５－１０ｍｇ／ＬＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］１０－３５０ｍｇ／Ｌ维生素Ｂ↓［１］０．５－１０ｍｇ／Ｌ维生素Ｂ↓［６］０．５－３０ｍｇ／Ｌ苯丙氨酸０．５－５ｍｇ／Ｌ苯甲酸钠５０－１０００ｍｇ／Ｌ乙酰水杨酸钠０．０１－５ｍｇ／Ｌ甲醇５－２０ｍｌ／Ｌ油酸１－１０ｍｌ／Ｌ，ｐＨ６．８；（２）菌体预培养；分别挑取产紫杉醇合成前体１０－去乙酰巴卡亭Ⅲ和巴卡亭Ⅲ内生真菌和产紫杉醇内生真菌的菌丝接种于含５０ｍｌＰＤＡ培养基的发酵瓶中，培养形成种子发酵液；（３）菌体生长培养：分别将上述两种真菌的种子发酵液接种于含５００ｍｌ发酵培养基的摇瓶中，培养得到含菌体和培养液的真菌菌液；（４）将上述两种发酵物（既真菌菌液）进行混合培养生产紫杉醇：将生长好的产紫杉醇内生真菌菌液与产紫杉醇合成前体１０－去乙酰巴卡亭Ⅲ和巴卡亭Ⅲ内生真菌菌液按１∶０．５～４．０的体积份数比混合，补加总体积的０．５－１．０倍的发酵培养基培养；（５）紫杉醇提取：将发酵物４０００ｒｐｍ离心１５ｍｉｎ，上清液和低温冻溶的菌体加等体积的乙酸乙酯超声波萃取１ｈ，重复提取２次；合并所有乙酸乙酯层，于５０℃旋转蒸干，甲醇洗涤，加入二氯甲烷和水１∶１（ｖ／ｖ）萃取后，将二氯甲烷蒸干，准确量取１ｍｌ乙醇溶解得到紫杉醇样品；（６）含量检测：紫杉醇样品过滤后上高效液相色谱柱，于２２８ｎｍ做定性及定量检测。
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